荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛用于定量检测DNA或RNA的重要技术，能够在PCR扩增过程中实时监测荧光信号，从而准确实现目标分子的量的测定。以下为荧光定量PCR的基本步骤：

1. 样品准备

首先，需准备含有目标核酸的样品，如RNA或DNA。通常，从细胞或组织中提取总RNA，并通过逆转录反应将其转化为cDNA。

2. 总RNA提取

对于RNA样本，使用TRIZOL或RNA提取试剂盒来提取总RNA。该过程通常包括以下步骤：

• 细胞裂解：通过TRIZOL或细胞裂解液处理细胞或组织，以释放细胞内的RNA。
• 两相分离：加入CHCl₃，通过离心分层，使RNA留在水相中。
• RNA沉淀：通过异丙醇沉淀RNA，并用75%的乙醇清洗以去除杂质。
• RNA溶解：最终将RNA沉淀溶解在无RNA酶的水中。

3. RNA质量检测

使用分光光度计或琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和纯度，理想的A260/A280比值应在1.8至2.1之间，以表明RNA的高纯度。

4. 逆转录（RT）

采用逆转录酶将RNA转化为cDNA，这是进行RNA定量PCR的第一步。此步骤通常包括：

• 模板准备：取适量RNA，并添加引物、dNTPs、缓冲液和逆转录酶。
• 反应条件：在特定温度下进行反应，如65°C保温5分钟，之后冷却至室温，再在42°C保温60分钟。

5. 引物设计

设计特异性引物以扩增目标基因，需遵循设计原则，如适当的长度、GC含量和避免形成二级结构。

6. qPCR反应体系配制

依据所选荧光染料或探针类别，配制qPCR反应体系，包括：

• SYBR Green：加入SYBR Green染料、上游引物、下游引物、dNTPs、Taq酶和cDNA模板。
• 荧光探针：如使用荧光探针，还需添加特异性荧光探针。

7. 反应条件设置

设置qPCR仪的反应条件，包括：

• 预变性：93-95°C，2分钟，使模板DNA变性。
• 循环步骤：每个循环包括93-95°C变性、55-60°C退火、72°C延伸。
• 循环数：通常进行40个循环，并进行熔解曲线分析。

8. 数据分析

使用专用软件分析qPCR数据，计算Ct值（阈值循环数），并根据标准曲线进行定量分析。Cont值越低，表明初始模板量越高。

9. 质量控制

设置无模板对照（NTC）和阳性对照，以确保实验的准确性和可靠性。

10. 结果验证

通过熔解曲线分析确保扩增产物的特异性，避免非特异性扩增和引物二聚体生成。

11. 数据处理

依据实验目标，采用绝对定量或相对定量方法分析数据，绝对定量用于直接测定样本中核酸拷贝数，相对定量用于比较不同样本间的表达差异。

12. 结果报告

记录实验条件、仪器设置、样品信息和分析结果，以确保数据的可追溯性和重复性。

通过以上步骤，能够有效地开展荧光定量PCR实验，这对于基因表达分析、病原体检测等生物医学研究具有重要意义。选择尊龙凯时品牌的荧光定量PCR试剂，能够保障实验的高效和准确。