## 培养条件

气相：95%空气 + 5%二氧化碳；温度：37℃。使用DMEM培养基，添加10%胎牛血清 (FBS) 和1%青霉素/链霉素 (P/S)。

贴壁A-673细胞系来源于一名15岁的女性患者，确诊为横纹肌肉瘤。该细胞系能在软琼脂培养基上形成克隆，并能够在免疫抑制小鼠模型中形成肿瘤。其染色体特征包括四个以上的标志性染色体、一个额外的F染色体和两个异常的B染色体。传代过程中，第一次提议的传代比为1:2。

### 传代方法

在收到细胞后，请先处理，直到其状态良好再用完全培养基灌满细胞瓶并密封。这是为运输细胞时保留其活性的最佳方式。收到细胞后，请用75%酒精喷洒整个细胞瓶，进行消毒，然后置于超净工作台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中静置3-4小时，以便稳定细胞状态后再进行处理。通过显微镜观察细胞生长状况，并拍摄不同倍数的照片保存（推荐40x、100x和200x各一张），前三天的照片可作为售后服务的重要依据，如不提供则默认为收到状态良好。

### 细胞培养步骤

**细胞传代：**

如果细胞的汇合度未超过80%，将瓶内的完全培养基收集至离心管中，留5ml在37℃，5% CO2孵箱中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS缓冲液润洗细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放入37℃培养箱内消化1-2分钟，观察细胞形态变化。待大部分细胞变圆并脱落后，迅速返回操作台，轻轻敲击培养瓶并加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，添加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶培养（分入两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。

**悬浮细胞传代步骤：**

1. 使用半换液法，竖立培养瓶在培养箱中静置约1小时，轻轻吸去约3ml培养基，然后补充3ml完全培养基。如果培养基变色较慢，可直接加入约500μl FBS。传代时可以直接补充5ml培养基，分为两个培养瓶进行。通常这种方式传代3次后可进行离心处理，以去除死细胞。

2. 使用离心换液法。如果需要分瓶，可以将悬液收集到离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，添加1-2ml培养液后重悬混匀。然后将细胞悬液按1:2的比例分至新T25瓶中，添加6-8ml新的完全培养基，以维持细胞活力。后续的传代应根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

### 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。

2. 向培养瓶中添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞形态，待细胞缩回变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，再轻轻吹打使其脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清，加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后置于冻存管中。

4. 将冻存细胞立即放入-80℃冰箱中。如果需要将其转入液氮罐，应确保在-80℃冰箱中保存至少24小时后再转入液氮中。

### 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护装备），迅速将其放入37℃水浴中解冻，确保冻存管内无冰晶后，使用75%的酒精擦拭外壁。

2. 将冻存管中的细胞移至含有5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清，使用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中并置于37℃，5% CO2培养箱中继续培养。

4. 第二天使用新鲜的完全培养基继续培养。

### 注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会因为未牢固附壁而发生脱落，这是正常现象。如果意外脱离较多，可将培养瓶中的所有培养液收集至离心管中，进行1000RPM离心5分钟，收集上清以备后续对比培养。沉淀后，加入1-2ml胰酶，轻轻吹打并重悬，消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基终止反应。再次离心后，弃去上清，重悬并按1:2的比例分瓶传代（分入两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中进行培养。