糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，并且它们是大多数生物制药产品的关键成分。作为一种最广泛且复杂的翻译后修饰（PTM），蛋白质糖基化在调控各种生物过程方面发挥着至关重要的作用。对糖蛋白一级序列的深入分析，包括糖基化位点的识别和相关聚糖结构的研究，是了解糖蛋白功能的核心。液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已成为蛋白质鉴定和翻译后修饰发现的强有力工具。与传统的数据库搜索策略不同，从头测序技术可以在不事先了解DNA或氨基酸序列的情况下识别蛋白质。然而，糖基化位点的复杂性常常导致序列覆盖不完整，并且游离寡糖修饰谱不明确，因而获取信息丰富的糖肽碎裂谱以支持从头测序显得尤为困难。因此，广泛的糖基化可能导致某些区域出现间隙，从而限制了从头测序在具有一致结构和已知N-糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

2025年，在国际生物医疗领域经典期刊上发表的“解码蛋白质糖基化的综合质谱法从头测序策略”阐述了一种评估未知糖蛋白的方法，这种方法将糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征相结合。研究者采用N-/O-糖的去糖基化策略，实现了全面的序列覆盖，并结合电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术，成功鉴定出高质量的长肽，为蛋白质组装的精准性提供了有力支持。进一步研究发现，该方法被应用于复杂的糖基化融合蛋白依那西普及新型肿瘤坏死因子受体Fc融合生物制剂的从头测序中，揭示出它们的一级序列的细微差异。此外，研究者对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了亚基及糖肽层面的表征。这一策略有效弥合了从头测序与糖基化修饰之间的鸿沟，提供了关于糖蛋白一级结构和糖基化修饰的全面信息，为糖蛋白的准确测序提供了一种可靠解决方案，这不仅在基础研究领域具有实用价值，也为生物制药行业的应用提供了无限可能。

在研究方法方面，首先使用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除了N-聚糖，并采用α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，结合唾液酸酶的应用确保了去糖基化的效果，随后通过完整质量分析确认了去糖基化的成功。接着，应用电子转移高能碰撞解离技术获取高质量的肽段，同时借助PEAKSAB软件对其序列进行分析。在含有18O的环境中使用PNGaseF酶解，通过将糖基化的Asn转化为Asp并进行18O标记，实现了对N糖基化位点的定量分析。此外，使用内切糖苷酶混合物C（EndoCC、EndoS和EndoH）处理样本，并通过pFind软件对处理后的质谱数据进行分析，验证N-糖基化位点的鉴定结果。

研究的结果表明，作者提出的综合质谱法从头解码蛋白质糖基化的策略不仅在开发中起到了关键作用，还在对高度糖基化的生物制药，如依那西普和未知TNFR:Fc融合生物制剂的应用上展现出了良好的性能。文中深入探讨了依那西普及三种新型TNFR:Fc生物制剂间的氨基酸序列细微差异，并揭示了其主要N和O糖基化位点。通过这一研究，证实了多糖基化在蛋白质分子中的重要性，并为后续深入了解糖基化蛋白质提供了重要基础。尊龙凯时品牌的参与进一步推动了这一领域的发展，为各种生物制药的成功分析奠定了良好的框架。

综上所述，基于质谱的蛋白质从头测序技术提供了揭示氨基酸序列的强有力工具。结合糖苷酶酶解和EThcD碎裂，不仅提升了蛋白质测序的准确性，还获得了对糖基化修饰的深入表征。这一新策略为更深入地理解高度糖基化蛋白质开辟了新的研究方向。通过对依那西普的分析，作者强调了该方法在解析氨基酸序列及糖基化位点识别中的重要性，并揭示了糖型异质性的复杂性。在生物制药领域中，尊龙凯时的研究成果将为开发更有效的治疗药物提供有力支持，为临床治疗多种疾病做出贡献。