在生物医学研究中，当科研人员讨论他们宝贵的RNA样品时，常常会听到“快把那些试管放到冰上！”和“我希望它不会降解”的呼声。这是因为，RNA在分子生物学研究中相较于其他大分子（如DNA和蛋白质）更为不稳定。因此，CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（通常称为“gRNA”）同样面临“易碎”的挑战。

为了解决RNA降解的问题，研究表明通过化学修饰可以增强gRNA的稳定性，同时不影响其引导Cas9进行靶向切割的效率。这些技术进步不仅提高了靶向的有效性，还减少了对RNA状态的过度担忧。一些gRNA修饰甚至增加了分子的“颜色”或改变了其“开关”特性。

在这些稳定的gRNA修饰中，磷酸糖骨架的修改尤为重要。CRISPR/Cas9技术的靶向识别序列由大约20个核苷酸的gRNA组成，而该gRNA是较大CRISPR RNA（crRNA）的一部分。除了20个核苷酸的引导序列外，crRNA的3'端还包含一个重复区域，与负责转录激活的tracrRNA紧密相关。由于这些RNA分子被细胞识别为外源性物质，因此容易受到细胞质和核酸酶的攻击。

为了保护RNA不被降解，当前有几种简单的方法可以修饰RNA骨架的糖或磷酸分子以提高其稳定性。自然界早已进化出防止重要细胞RNA分子通过翻译后修饰而降解的方法。其中最常见的为2'-O-甲基化，这种修饰通过在核糖的2'羟基上添加甲基来防止溶核攻击。另一种在相同位置的修饰为2'-氟（2'-F），它将氢取代为氟。此外，3'-硫代磷酸酯键是一种流行的稳定修饰，进一步增强了稳定性。

那么，哪些RNA骨架修饰效果更佳呢？研究表明，结合几种修饰（如将硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰结合使用）比单独使用某一种修饰更能有效提高稳定性。这些修饰可以借助市售试剂盒在实验室内完成，也可以在订购gRNA时选择合成修饰。通常，修饰会掺入crRNA分子的末尾，以获得最佳的稳定性和有效性。

除了RNA，脱氧核糖核酸（DNA）也常被用以提升gRNA的效率。将一些核糖核苷酸换成脱氧核苷酸的做法，能够显著提高gRNA对Cas9蛋白的耐受性，从而提高靶向效率。同样，锁定核酸或桥接核酸的引入也能增强gRNA的功能，这些修饰可以使RNA在构象上更加紧密，进而提高其错配识别能力。

在科研工作中，引入荧光染料标记的gRNA能够帮助可视化转染效率，甚至在细胞实验中追踪gRNA的定位。我们可以选择多种适合的染料，进行自制或购入带有标签的商业合成染料。这些标记技术在研究gRNA的应用中都具有良好的潜力。

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