细胞凋亡是一个生物学过程，常伴随显著的细胞形态学变化。在凋亡早期，细胞质膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转到细胞膜的外侧；而在凋亡的中后期，随着细胞质膜通透性的增加，一些较大的分子物质，例如碘化丙啶（PI），可以自由进入细胞并使细胞核显现红色荧光。

Annexin V-PI 检测法原理

Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能够与磷脂酰丝氨酸（PS）以高亲和力特异性结合。完整的细胞膜对该蛋白不具渗透性，而早期凋亡细胞的细胞膜仍然完好，因此不易被PI染色。但在凋亡中晚期以及死亡细胞中，PI能够穿透细胞膜并对细胞核施加染色作用。因此，联合使用Annexin V和PI可有效区分早期凋亡细胞与其他细胞。

尊龙凯时Annexin V-PI 凋亡检测试剂盒

[名称] 流式凋亡检测试剂盒
[货号] AC12L033
[规格] 100T

操作步骤

对照管设置

1. 空白管：不加入染料的诱导凋亡细胞，调节电压；
2. 单染管：分别添加PI和荧光标记的Annexin V的单染管，进行补偿调节；
3. 实验管：在诱导凋亡的细胞中加入本次实验的所有荧光染料；
4. 阴性管：对照正常培养细胞加入染料，以确保细胞在正常状态下以排除假阳性。

悬浮细胞染色

1. 在细胞凋亡刺激后，进行5分钟的离心，弃掉上清液，收集细胞，并用PBS轻轻重悬并计数；
2. 取1~5×10^5重悬细胞，离心5分钟后弃去上清，加入500µl结合液轻轻重悬细胞；
3. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；之后加入5µl碘化丙啶，轻轻混匀；
4. 室温避光孵育10分钟，可使用铝箔保护；
5. 随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

贴壁细胞染色

1. 将细胞培养液吸出至合适的离心管，PBS洗涤贴壁细胞一次，然后使用胰酶消化细胞（尽量避免使用含有EDTA的消化液）；
2. 细胞消化后，按照悬浮细胞的操作步骤进行处理。

上机检测

染色孵育后，立即进行流式细胞仪或者荧光显微镜检测。

注意事项

• 在检测贴壁细胞时，如果难以控制消化时间，建议使用Accutase细胞消化液，因为它对细胞的损伤较小且不会改变细胞膜上PS的分布；
• 选择Annexin V的荧光染料时需要考虑细胞的自发荧光，尤其是经过长时间培养或药物处理的细胞，必须注意细胞代谢物或药物本身的荧光。通常，细胞代谢物的自发荧光会干扰FITC/PE，因此推荐使用Annexin V-APC；建议检查药物本身的发射光谱，确保不影响所选染料的检测；
• 细胞染色完成后应立即检测，禁止固定，检测管可置于冰上以减少环境对检测结果的影响；
• 在进行凋亡统计时，通常应重点统计前凋亡，因为只有前凋亡才具备临床意义。虽然一些文献也统计总的凋亡比例（前凋亡和晚期凋亡之和），但单独统计晚期凋亡的意义相对较小。